“我们开发的新一代碱基编辑器，在高版本工业底盘菌株开发中具有巨大潜力。审稿人表示这是基因编辑技术领域的一项重要突破。”江南大学助理研究员韩来闯表示。
图 | 韩来闯（来源：韩来闯）
近日，他和所在团队利用复合体结构导向的 Cas 蛋白优选、融合方式优化等手段，将碱基编辑器的编辑窗口大幅提至最高 41nt。
这极大拓展了碱基编辑器的应用范围，让利用碱基编辑器来构建细胞突变库成为可能，也让创制高性能底盘菌株成为可能。
在碱基编辑器工作原理上，课题组也实现了新的突破。其发现，基于序列和蛋白结构的比对分析，可以更好地确定 Cas 蛋白功能关键位点并加以改造。
此外，他们还探索了不同融合方式对于编辑窗口的影响，并将其与 Cas 蛋白和脱氨酶空间位阻效应进行关联。
研究中，他们在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌这两个重要模式细菌中加以测试。
通过在枯草芽孢杆菌的启动子和核糖体的结合位点，引入大范围的突变和筛选，他们获得了一种“启动子+核糖体”的结合位点组合。
相比出发组合的表达强度，本次组合的表达强度提升了 68.1 倍。
针对大肠杆菌 Tat 分泌系统的关键基因，课题组也进行了原位改造，借此筛选得到一种底盘细胞，它的分泌能力同比提升 6.49 倍。
总的来说，本次研究瞄准工业菌株改造的痛点，探索了 Cas 蛋白选择、脱氨酶融合方式等因素对于编辑窗口的影响，展示了生物结构分析对于基因编辑系统开发的重要作用。
（来源：Advanced Science）
亟需开发性能更优的底盘细胞
当前，随着能源供给、粮食安全、环境压力等问题变得日益严峻，如何实现绿色可持续的发展，是人类共同关注的话题。
在这种情况之下，合成生物学应运而生。它是指在工程学思想的指导之下，对生物体进行有目标的设计、改造，甚至创建拥有非自然功能的“人造生命”，即实现生命系统的工程化。
继“发现 DNA 双螺旋结构”和“人类基因组测序计划”之后，合成生物学被认为是人类的第三次生物技术革命。
作为一种底层技术，合成生物学已经在多个行业中产生了深远影响，包括生物发酵、化工、食品、医药等，并正快速向环境、农业、材料、能源等行业延展。
它的广泛应用和快速发展，证明其在实现绿色制造、碳中和、大健康等宏大目标中具备巨大潜力。
毋庸置疑，合成生物学将给传统生产制造方式带来深刻变革。工业菌株，是合成生物制造的“灵魂”。高版本的工业底盘菌株的创制，是合成生物学的研究热点。
这是因为通过优化底盘菌株，可以进一步提高生物制造过程的效率和产量，从而推动相关行业的快速发展。其中，高效的基因编辑技术扮演着关键角色。
目前，人们已经发展出多种基因编辑技术，并且各有各的特色。
其中，CRISPR-Cas 基因编辑技术是一款革命性的基因编辑工具，自 2012 年诞生以来便在生医领域引起了巨大轰动。
相比传统的基因编辑技术，CRISPR-Cas 具有成本低、易操作、效率高等优势。
此前，通过利用 Cas 蛋白的核酸切割活性，人们已经实现了基因失活、无痕敲除、外源基因重组等功能。
而更为重要的是，CRISPR-Cas 的精准定位特性，为基因编辑带来了无限可能。
比如，使用失去核酸切割活性的 Cas 蛋白融合转录因子，可以改变基因的表达强度，从而能被用来打造基因表达调控系统。
再比如，使用失去核酸切割活性的 Cas 蛋白融合具备报告功能的蛋白，因此可以作为标记工具来使用，进而用于细胞成像。
不同于利用 CRISPR-Cas 系统切割功能的基因改造，当把碱基脱氨酶融合在 Cas 蛋白上的时候，在 Cas 蛋白精确定位的帮助之下，脱氨酶可以在基因的特定位置发挥作用。
这让脱氨酶可以直接通过酶催化的方式，来改变基因的碱基序列，人们将该系统形象地称为“碱基编辑器”。
对于这种基因编辑过程来说，它不会对基因进行切割，所以不会导致基因结构被破坏。这让它不仅具备较高的效率，对于宿主细胞的压力也相对较小。
事实上，针对蛋白质或细胞进行改造，本质上都是在基因层面引入突变，从而改变生物活性。
然而，受限于当前的遗传操作技术水平，对于绝大多数基因来说，都很难通过克隆和体外基因工程操作进行改造。
而一些多组分系统，它们不仅含有较大的基因簇，功能也非常复杂。因此，只能在基因组上进行原位改造。
碱基编辑器，是在原位改造基因的有效工具，它能定点地改变基因序列，也能构建包含多种突变的库，从而可以进行表型筛选。
不过，编辑窗口难题——是碱基编辑器当前面临的主要限制因素之一。
之前的碱基编辑器，通常只能编辑 5-7nt 范围的碱基，最多只能发生 2-3 个氨基酸的突变，这极大限制了碱基编辑器的应用。
而之所以开展本次工作，是基于课题组长期从事生物催化研究时所遇到的问题。
从酶和表达宿主的匹配性角度来看，不同的酶需要选择合适的宿主来表达，但是在同一宿主内表达不同的酶，其效果又会大相径庭。
从酶的表达方式角度来看，有些酶适合胞内表达，有些则适合分泌到细胞外表达。
为此，该团队曾做过大量的表达系统，比如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、丝状真菌等。
对于一些复杂的级联催化反应来说，需要针对酶的协同表达进行严密调控。此外，有些基因只能在体内发挥功能，很难克隆出来进行改造。
在这些问题的背后都指向着一个共同问题：如何高效地开发性能更优的底盘细胞。
经过一番调研，他们认为 CRISPR-Cas 技术是解决上述问题的较优选择。
（来源：Advanced Science）
积极拥抱 AI 技术，为开发碱基编辑器提供重要依据
在此之前，该团队曾使用 CRISPR-Cas 技术分别在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和构巢曲霉中构建了相关系统，实现了基因敲除、基因敲入、以及调节基因表达。
在此基础之上，他们决定将 CRISPR-Cas 技术的开发和应用，作为本次研究的重点之一。
如前所述，尽管基因编辑技术已经取得了一定进展，但在处理大基因簇和复杂多组分系统上仍然存在局限性。
因此，他们决定将研究焦点放在如何扩展碱基编辑器的编辑窗口上，以便提高其应用范围。
在实验设计阶段，课题组综合考虑了 Cas 蛋白的选择、脱氨酶的融合方式等多个因素对于编辑窗口的影响。
通过对比分析和结构预测，筛选出了具有潜在优势的 Cas 蛋白，并通过设计不同融合方案进行测试。
同时，他们还构建了一系列的测试载体和底盘菌株，以便验证碱基编辑器的性能和应用潜力。
通过比较不同编辑窗口之下的编辑器性能差异，评估了构建突变库的稳定性和可靠性。
并利用生物信息学手段，针对编辑结果进行预测和验证，进一步证实了编辑器的准确性和有效性。
另外，他们还通过使用基于深度学习模型的结构预测工具 RosettaFoldNA，来对 Cas 蛋白-核酸的结构进行预测分析，这为碱基编辑器的开发提供了重要依据。
（来源：Advanced Science）
最终，相关论文以《基于 CRISPR-CS12B 工程的新型基编辑器, 带有扩大编辑窗口, 用于微生物细胞的体内进化》（A New-Generation Base Editor with an Expanded Editing Window for Microbial Cell Evolution In Vivo Based on CRISPR‒Cas12b Engineering）为题发在 Advanced Science（IF 15.1）。
江南大学博士生郝文亮是第一作者，韩来闯和江南大学教授周哲敏担任共同通讯作者 [1]。
图 | 相关论文（来源：Advanced Science）
后续，他们将继续开展三方面的工作：
其一，基于碱基编辑器的基因，提升原位改造技术的应用能力。
届时，他们将在典型模式菌中开展上述探索，针对所感兴趣的生物功能系统的关键基因来构建突变体库，从而获得性能优良的底盘细胞。
其二，开展非模式菌株的适用性研究。
尽管本次系统在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中具备良好的验证效果，但是这远远不够。
工业菌株种类繁多，很多都是非模式菌株。因此，他们将在非模式菌株中测试本次工具，针对一些适配性问题加以优化，拓展本次技术的应用范围。
其三，开发性能更佳的基因编辑系统。
基因原位改造的方式，不仅繁多而且各有优势。因此，课题组将仍以“基因原位突变体库构建和改造”为落脚点，开发新的基因编辑系统。
与此同时，该团队也正在使用 AI 序列生成模型，来设计人工脱氨酶、优化 Cas 蛋白和脱氨酶的融合方式等。
其认为 AI 的快速发展一定会颠覆传统的生物技术研究方式，即从之前的机制驱动（先理解再设计），转变为数据驱动（先设计再理解）。
参考资料：
1.Hao, W., Cui, W., Liu, Z., Suo, F., Wu, Y., Han, L., & Zhou, Z. (2024). A New‐Generation Base Editor with an Expanded Editing Window for Microbial Cell Evolution In Vivo Based on CRISPR‒Cas12b Engineering.Advanced Science, 2309767.
支持：Ren
排版：初嘉实
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