近日，上海交通大学研究员和合作者，成功绕过天然途径的固有弊端，实现了丙二酰辅酶 A（malonyl-CoA）及其衍生物的高效合成。

图 | 谭在高（来源：）

“截至目前，有很多国内外同行都对我们构建的新途径非常感兴趣，他们都希望能将它用到自己的研究中。”表示。

研究中，等人所构建的丙二酰辅酶 A 合成新途径，有效克服了天然途径存在的传统问题。

这不仅提高了多种底盘细胞内的丙二酰辅酶 A 产量，也为丙二酰辅酶 A 及其相关产品的开发提供了极大可能。

由于丙二酰辅酶 A 是合成所有脂肪酸类、聚酮类化合物以及合成黄酮类化合物的前体，因此本次新途径可被用于这些化合物的高效合成之中。

目前，人们已经发现 10000 多种不同的聚酮类化合物，由之衍生的新产物更是不计其数。据统计，有超过 20 多种聚酮类化合物（例如红霉素、四环素、洛伐他汀、阿维菌素等）已成为商业化药物。

其中，在医药业和畜牧业中，红霉素是最常用的大环内酯类抗生素。而包括洛伐他汀在内的他汀类药物的销售额，在降血脂药物市场总销售额中占比 80% 以上。目前，上述 20 多种药物的全球年销售额已超过 200 亿美元。

黄酮类化合物，也是一种广泛存在的次级代谢产物，当前已被发现的黄酮类化合物超过 8000 种，大部分具有良好的抗病毒、抗菌、抗炎、抗癌和抗肥胖等生理活性。

预计到 2024 年，黄酮类化合物市场将达到 12 亿美元。因此，课题组认为本次提出的生物合成新途径具有广阔的应用前景。

（来源：Nature Catalysis）

天然途径却并不完美

如前所述，丙二酰辅酶 A——是合成脂肪酸、聚酮化合物、黄酮类化合物等 3 万多种高值化合物的共同前体。

但是，此前不少研究均表明，胞内的丙二酰辅酶 A 处于供给不足的状态，这让高值衍生物的高效生物合成遭到限制。

在几乎在所有的生物体中，丙二酰辅酶 A 的合成都非常保守。即在丙酮酸脱氢酶（PDH，pyruvate dehydrogenase）的催化之下，丙酮酸可以形成乙酰辅酶 A（acetyl-CoA）。

而在乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC，Acetyl CoA carboxylase）的催化之下，乙酰辅酶 A 可以形成丙二酰辅酶 A。

然而，从高效生物合成的角度来看，尽管 PDH-ACC 是一条天然途径，但是它并不完美。

这种途径的催化速率往往偏低，活性仅为 nmol/min/mg 级。脱羧反应会产生温室气体二氧化碳，从而造成碳源浪费。而羧化则需要消耗腺嘌呤核苷三磷酸，因此会造成能量浪费。

此外，脱羧反应会受到胞内多种代谢物的严格调控。这些弊端的存在，是导致丙二酰辅酶 A 供给不足的主要因素。

那么，该如何提高丙二酰辅酶 A 的供给？此前，学界将重点放在提高天然途径的表达。

主要采取的手段有两种：其一，过表达乙酰辅酶 A 羧化酶；其二，让乙酰辅酶 A 羧化酶发生突变从而提高其活性。

但是，这并不能解决天然途径碳效率低下和能量效率低下等固有缺陷。并且，有不少研究报道，过表达乙酰辅酶 A 羧化酶，会导致细胞的生长受到抑制。

（来源：Nature Catalysis）

规避天然途径的弊端

因此，团队没有继续将精力集中在天然合成途径的优化上。

而是另辟蹊径，尝试构建一条新的丙二酰辅酶 A 合成途径，希望在提高丙二酰辅酶 A 合成速率的同时，规避天然途径所存在的弊端。

研究中，摆在他们面前的第一件事，便是选取丙二酰辅酶 A 合成底物。胞内代谢通量是否足够大，是主要的选取原则。

在细胞中，丙酮酸不仅是一种非常常见的中心代谢物，而且合成通量非常大。于是，该团队选取它作为合成底物。

但是，从丙酮酸生成丙二酰辅酶 A 不可能一蹴而就，中间需要历经几个步骤。

而为了避免二氧化碳释放造成的碳源浪费，所以他们不再考虑使用脱羧反应，于是在中间物上选取了 C3 型。

在众多 C3 化合物中，他们发现 3-氧代丙酸很有可能通过一步反应合成丙二酰辅酶 A，而丙酮酸也只需通过一步转氨反应就能得到 3-氧代丙酸。

也就是说在理想情况之下，对于丙酮酸来说它只需要通过两步反应，即可合成丙二酰辅酶 A。

确定中间产物之后，课题组在数据库中搜索可能涉及到的反应。结果发现：对于上述第一步反应，可以由转氨反应完成；对于上述第二步反应，此前还没有相关报道。

但是，有研究表明在 MCR-C（the C-terminal fragment of malonyl-CoA reductase）的作用之下，丙二酰辅酶 A 可以合成 3-氧代丙酸。

课题组推测：针对相关逆反应进行催化，或许也是一条可行的道路。通过一番计算他们发现，从 3-氧代丙酸到丙二酰辅酶 A 的反应，能够在热力学上找到一定的依据。

因此，他们选定这一类酶作为第二步反应的候选酶。对于自然途径来说，它所采用的是“C3（丙酮酸）-C2（乙酰辅酶 A）-C3（丙二酰辅酶 A）”这样一种先脱羧、再羧化的途径。

而该团队设计了一种“C3（丙酮酸）-C3（3-氧代丙酸）-C3（丙二酰辅酶 A）”的新途径，摆脱了碳源浪费和能量消耗等弊端。

后来，他们将这种途径称之为 NCM 途径（non-carboxylative malonyl-CoA formation pathway）。

接下来，他们开始进行酶的挖掘，将候选酶用于进行体外反应。并通过还原酶催化的还原反应所合成的还原型辅酶 Ⅱ，在 340nM 处吸收数值的增加速度，来判断候选酶的强弱。

以及通过液质联用技术，来检测体外反应产物。在这种双重验证之下， NCM 途径的体外可行性得到了证明，并且活性非常高，达到了µmol/min/mg级，是天然合成途径（nmol/min/mg 级）的 1000 倍。

（来源：Nature Catalysis）

得到两支外部团队的大力支援

事实上，在最初几次的液质联用技术检测中，他们始终检测不到丙二酰辅酶 A。本文的第一作者李健，也是研究员在上海交通大学招收的第一位博士研究生，认为可能有如下两个原因：

一是丙二酰辅酶 A 的检测信号不强，而体外反应合成的丙二酰辅酶 A 太少，所以检测不到；

二是丙二酰辅酶 A 太不稳定，在处理过程中已经分解了不少。

为了解决这些问题，他们决定将大部分实验在 4℃ 的条件下进行，并对体外反应产物进行富集。经过这些优化，终于成功检测到目标产物。

体外实验结果证明：NCM 途径具备一定的可行性。那么，在细胞内是否也可以应用？

想要精确地测定胞内丙二酰辅酶 A 的合成通量，需要用到 C13 代谢流分析。

考虑到中国科学院分子植物科学卓越创新中心研究员在 C13 代谢流分析上，是一位非常权威的专家。

于是，团队开始寻求与团队合作。在研究员的指导下，董文越博士生的研究表明，将 NCM 途径引入大肠杆菌后，胞内有 57% 的丙二酰辅酶 A 是通过 NCM 途径产生的，这直接证明 NCM 途径在细胞内是可行的。

此外，对天然途径合成酶乙酰辅酶 A 羧化酶进行过表达，会让细胞生长受到抑制。那么，过表达 NCM 途径是否会有类似情况？

一番研究之后他们发现，过表达 NCM 途径对于细胞生长并没有明显的抑制。

那么，引入 NCM 途径是否会对细胞鲁棒性产生影响？经过实验得知，将 NCM 途径引入大肠杆菌之后，即便处于由有机酸、毒性聚酮化合物、高渗透压等不利生长条件导致的生长抑制环境之中，细胞对于这种环境的耐受性反而能够提高。

而在这些胁迫条件之下，过表达乙酰辅酶 A 羧化酶的菌株，则生长得非常缓慢。

随后，团队还测试了 NCM 途径在丙二酰辅酶 A 衍生物合成方面的应用。

在模式菌株大肠杆菌中，他们将 NCM 途径用于辛酸、间苯三酚、淡黄霉素和十五碳烯等丙二酰辅酶 A 衍生物的合成，结果发现这些产物的产量都得到了显著提高。

那么，NCM 途径的应用场景是否可以更广泛？它是不是可以在不同底盘细胞中起到作用？

后来，他们打算在链霉菌中测试 NCM 途径效果，因为链霉菌是天然的聚酮类化合物合成底盘，很多商业化药品都是聚酮类化合物。

为此，团队开始寻求与上海交通大学团队进行合作。在教授的指导之下，武汉大学的慕昕博士生将 NCM 途径引入褐黄孢链霉菌之中，以用于生产纳他霉素；以及将 NCM 途径引入刺糖多孢菌之中，以用于生产多杀菌素。

结果发现：纳他霉素和多杀菌素的产量都能得到显著提高。其中，多杀菌素摇瓶的产量更是达到 4.6g/L，这是已有报道中的最高水平，也意味着他们已经实现工业化量产。

最终，相关论文以《一种有效合成中心代谢物丙二酰辅酶 A 及其衍生物的非羧基化路线》（）为题发在 Nature Catalysis[1]。

上海交通大学博士生李健、武汉大学博士生慕昕、中科院分子植物卓越中心博士生董文越是共同一作。

上海交通大学研究员和教授、中科院分子植物科学卓越创新中心研究员担任共同通讯作者。

图 | 相关论文（来源：Nature Catalysis）

目前，研究员已经获得 2024 年国家自然科学基金的支持。因此，除了 NCM 途径之外，他们还打算利用其它不同类型的底物，实现丙二酰辅酶 A 的高效合成。

眼下，他们已经实现了从多种底物到丙二酰辅酶 A 非天然合成途径的创制。

相比天然途径，这些途径展现出显著的催化优势。因此，下一步他们将开展丙二酰辅酶 A 衍生物的高效合成。

参考资料：

1.Li, J., Mu, X., Dong, W.et al. A non-carboxylative route for the efficient synthesis of central metabolite malonyl-CoA and its derived products. Nat Catal (2024). https://doi.org/10.1038/s41929-023-01103-2

运营/排版：何晨龙

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